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荧光显微镜的发展为研究者进一步深入调查提供的可靠信息
点击次数:21 发布时间:2020-04-20
   一、荧光显微镜简要原理
  荧光显微镜的基本构造通常由普通光学显微镜再加一些如荧光光源、激发滤片、双色束分离器及阻断滤片等附件的基础上组成。同时采用的荧光光源一般为超高压汞灯,它可发出各种波长的光,且每种荧光物质都会有一个产生最强荧光的激发光波长,这时需加置激发滤片,通常有紫外、紫色、蓝色及绿色激发滤片,仅需使一定波长的激发光透过并照射到标本上,并将其他光都吸收掉。
  二、影响到荧光显微镜成像效果的因素
  影响荧光显微镜成像的荧光因素很多,主要包括:荧光样品的制备,荧光光源的选择,滤片转盘的设计,荧光滤片的组合策略(激发光滤片,发射光滤片,双色镜分光滤片,带宽选择),显微镜物镜种类,显微镜摄像系统的选择等问题。荧光的激发、滤光、成像、淬灭,荧光实验的调整就是怎么才能协调好以上因素得到最好的效果,其中影响到成像效果的一个重要因素即是荧光光源。
  三、荧光显微镜光源种类及介绍
  荧光显微镜的常用光源通常都是白光光源:高压汞灯,氙灯,金属卤素灯和LED白光光源以及高端的LED单波长光源。
  1、汞灯
  超高压汞灯(50-200W),它是用石英玻璃制作,中间呈球形,内充一定数量的汞,工作时由两个电极间放电,引起汞蒸发,球内气压迅速升高,当汞完全蒸发时,可达50~70个标准大气压力,这一过程一般约需5~15min。
  2、氙灯
  氙灯和汞灯做为白光源,都能提供从紫外到近红外一系列波长的光,但它们却有着不同的激发光谱。汞灯集中在近紫外、蓝光以及绿光附近,这种在峰值的高激发能量确保产生明亮的荧光信号,但光毒性却很强。
  3、金属卤素灯
  目前各大显微镜品牌广泛使用的一种光源,它和汞灯的激发光谱很像,但它和显微镜以光纤相连,能散热,寿命更长。光纤从光源连到显微镜上,可以大量减少光产生的热能。金属卤素灯对活细胞成像的另一个优势是内置强度设计装置,可以容易调节激发光。也可以通过选择直接连接获得更好的激发效果。
  4、LED白光荧光光源
  这种光源的开关在毫秒间,减少样品在光照下的暴露时间,延长寿命。另外,LED光的衰减即快又精确,长期活细胞试验下可大大减少光毒性。和白光相比,LED仅仅在一个较窄的光谱激发,多个LED波段使得LED光源能为多色荧光提供应用。
  5.LED单波长荧光光源
  此类光源属于高端的荧光光源,价格昂贵。采用单波长LED模块设计,输出单个波长的荧光谱线,例如365nm/488nm/561nm/633nm,类似于激光光源。此类优点突出;寿命长,采用光电快速切换,有效避免物理震动。LED单模块光源的单色性好,极大的降低了白光光源的背景噪音,高效激发。程序控制适合整合到高端的成像系统中。
  四、总结
  在过去的十几年中荧光显微镜以惊人的速度在进化,与荧光显微镜密切相关的荧光染料及探针不断被发明,光电技术发展同样迅速,创新的激光共聚焦成像技术,多光子成像技术,脉冲激发技术,高灵敏度固态探测器,高数值孔径物镜和各种不断开发出来的基于计算机图像分析方法,帮助生物医学研究者进一步深入调查基于荧光的生物现象,让研究者深入探究在自然环境中在活细胞内。同时免疫荧光在医学研究、诊断领域里的广泛应用,FISH、各种荧光蛋白技术分别在基因组学、蛋白质组学研究方面的推广,生物医学科研对仪器需要越来越高,先进的的荧光仪器和配件的发展将毫无疑问地继续。
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